Bewertung eines neuartigen antiviralen Filters mittels Pseudo

Aug 28, 2023

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 13947 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Aktuelle Erkenntnisse deuten darauf hin, dass das schwere Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) mit schwerem akutem respiratorischem Syndrom in schlecht belüfteten Innenräumen über einen längeren Zeitraum in Aerosolen schwebend bleiben kann. Um die Ausbreitung zu minimieren, kann der Einsatz eines antiviralen Filters zum Auffangen infektiöser Aerosole und zur Inaktivierung von SARS-CoV-2 eine vielversprechende Lösung sein. Ziel dieser Studie war die Entwicklung einer Methode zur gleichzeitigen Bewertung der Filtrations- und Entfernungseffizienz von aerosolisiertem Pseudotyp SARS-CoV-2 unter Verwendung eines vertikalen Windkanals mit relativ hoher Anströmgeschwindigkeit (1,3 m/s). Im Vergleich zum unbehandelten Spunlace-Vliesfilter steigerte der mit C-POLAR™ behandelte Filter die Filtrationseffizienz von 74,2 ± 11,5 % auf 97,2 ± 1,7 %, bei einer Entfernungseffizienz von 99,4 ± 0,051 %. Die Ergebnisse lieferten nicht nur solide Beweise für die Wirksamkeit des mit kationischem Polymer beschichteten Filters im Kampf gegen die SARS-CoV-2-Pandemie, sondern auch eine Methode zum Testen der Effizienz der Virusfiltration und -entfernung bei relativ hoher Luftgeschwindigkeit und in einer sichereren Umgebung die Betreiber.

Bis Mai 2023 hat der Ausbruch der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) weltweit mehr als 766 Millionen Fälle und mehr als 6,9 Millionen Todesfälle verursacht1. Die Krankheit wird durch ein einzelsträngiges RNA-Virus mit positivem Sinn namens „Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2“ (SARS-CoV-2)2 mit sphärischer oder elliptischer Morphologie verursacht. Der Durchmesser von SARS-CoV-2 beträgt etwa 60–140 nm, mit einem kronenähnlichen Aussehen aufgrund der Expression von Spike-Glykoproteinen auf der Hüllenoberfläche. Einige Studien legen nahe, dass die Spike-Glykoproteine ​​für die Rezeptorbindung und den Eintritt in die Wirtszelle verantwortlich sind3 ,4. Die Übertragung von Mensch zu Mensch kann auf verschiedene Weise erfolgen, einschließlich der Übertragung über kurze Distanzen in der Luft5 durch Zerstäubung von SARS-CoV-2 in Atemtröpfchen (≥ 5 μm) und feinen Aerosolen (< 5 μm) durch Einatmen, Husten oder Niesen eine infizierte Person6. Fears et al.7 zeigten auch, dass SARS-CoV-2 in Aerosolsuspensionen mit einem massenmedianen aerodynamischen Durchmesser von etwa 2 μm persistiert.

Um das Infektionsrisiko zu verringern, wurden daher verschiedene Arten von Filtern eingesetzt, um das aerosolisierte SARS-CoV-2 zu reduzieren, wie etwa schmelzgeblasenes Polypropylen (MBPP)-Elektretgewebe8 und hocheffiziente Partikelluft (HEPA) zum Heizen, Lüftungs- und Klimaanlage (HVAC)9. Da es schwierig ist, Viren in Luftproben zu quantifizieren, wurden viele Studien zur Filtrationseffizienz durchgeführt, indem man etwaige verbleibende virale RNA-Kontaminationen vor Ort beobachtete oder Aerosole mit Salzlösungen oder Bakterien als Modell zur Nachahmung von Viren verwendete. Es mangelt an einer Standardmethode zur direkten Bewertung der Virusentfernungseffizienz10, insbesondere bei Filtern, die in einer Klimaanlage oder einem Luftreiniger mit relativ hoher Anströmgeschwindigkeit verwendet werden, was weiterhin Unsicherheit hinsichtlich der Wirksamkeit von Filtermaterialien bei der Prävention einer SARS-CoV-2-Infektion darstellt .

Neben der Reduzierung von Bioaerosolen durch wirksame Filterung ist es auch wichtig, das Virus zu inaktivieren, um Fouling und Sekundärübertragung zu verhindern. In einigen Studien wurde die Verwendung von UV-C11 und dielektrischer Filterentladung12 zur Inaktivierung von SARS-CoV-2-Bioaerosol vorgeschlagen. Diese Systeme haben ihre eigenen Einschränkungen, einschließlich des Energieverbrauchs, und erhöhen die Ozonkonzentration in der behandelten Luft. Kürzlich wurde von C-POLAR™ Technologies, Inc. (https://cpolartechnologies.com) ein mit kationischem Polymer beschichtetes Filtersystem eingeführt, das als C-POLAR™ behandelter Filter bezeichnet wird und aus einem Polyamin besteht, einem kationischen Polymer, das weit verbreitet ist als Genübertragungsvektor mit hohen Transfektionseffizienzen13. Das C-POLAR™-Material wurde als Beschichtung auf Spunlace-Filtern verwendet, um die Aufnahme negativ polarer Mikroben im Aerosol zu erhöhen und Mikroben durch das Eindringen in Membran und Hülle durch seine hohe Dichte an positiv polaren Gruppen entlang der Rückgratkette zu inaktivieren.

In dieser Studie wurde ein vertikaler Windkanal entwickelt (Abb. 1), um die Filtrationseffizienz und die Anti-SARS-CoV-2-Eigenschaft des Filters mit C-POLAR™-behandeltem Filter zu bewerten. Um die Filtrationseffizienz mit einem über die Luft übertragbaren Wildtypvirus wie SARS-CoV-2 zu beurteilen, ist das Gesundheitsrisiko der Erzeugung aerosolisierter Viren viel höher als bei der Kultivierung desselben Virus in einer Lösung. Die Verwendung einer sichereren Alternative wie eines Pseudotyp-Virus kann das Gesundheitsrisiko der Bediener verringern und die Zugänglichkeit zu Laboratorien der Biosicherheitsstufe 2 verbessern14. Beim Pseudotyp-Virus handelt es sich um ein genetisch verändertes Virus mit im Vergleich zum Wildtyp abgeschwächter Virulenz, bei dem die native Oberflächenproteinexpression aufgehoben und durch die gewünschten Oberflächenproteine ​​ersetzt wird. Das resultierende Pseudotyp-Virus kann die Wirtszelle weiterhin infizieren, sich jedoch nicht darin vermehren15. Wichtig ist, dass die Studie eine Methode zur Bewertung anderer Filtersysteme hinsichtlich ihrer Filtrationseffizienz und antimikrobiellen Eigenschaften in einer Umgebung mit relativ hoher Luftgeschwindigkeit bietet.

Schematische Darstellung des vertikalen Windkanals.

Im Vergleich zu herkömmlichen Assays zeigte die Verwendung des Pseudotyp-Virus-Assays eine gute Korrelation mit Wildtyp-SARS-CoV-2-Assays, während gleichzeitig ein hoher Durchsatz aufrechterhalten wurde und weniger Anforderungen an die biologische Sicherheit des Labors gestellt wurden16,17. Obwohl die Virulenz des Pseudotyps SARS-CoV-2 deutlich geringer ist als die des Wildtyps, wurde der Windkanal unter Unterdruck mithilfe einer Vakuumpumpe konstruiert, um das Risiko eines versehentlichen Austritts des Pseudovirus zu minimieren -Typ-Virus in die Atmosphäre18, wo die Bioaerosole zusammen mit der Frischluft am Eingang bis zum Test (stromaufwärts), dem PTFE-Filter (stromabwärts) und dem Entlüftungsfilter (HEPA) gelangen und am Auslass freigesetzt werden. Der gesamte Aufbau wurde zusammen mit dem Abgas in der Biosicherheitswerkbank zirkuliert, um die Sicherheit des Bedieners während des Experiments zu gewährleisten. Das Design des Windkanals, der eine vertikale Konfiguration anstelle eines herkömmlichen horizontalen Typs verwendet, besteht darin, die Auswirkungen von Aerosol- und Tröpfchenpartikeln, die sich durch die Schwerkraftbeschleunigung auf der horizontalen Kanaloberfläche absetzen, zu minimieren und die Rückgewinnung des Viruseintrags zu erhöhen19. Die Einströmgeschwindigkeit des Windkanals (d. h. 1,3 m/s) war vergleichbar mit den Anforderungen des ASHRAE-Standards 52.2 für die Gleichmäßigkeitsprüfung des Standardtestkanals20. Der aerodynamische Massendurchmesser des vom Vernebler erzeugten Aerosols (d. h. 1,72 ± 0,26 μm) ähnelt anderen Studien zur Virusfiltrationsleistung18,21,22. McCluskey et al.23 gaben an, dass Aerosole im Größenbereich von 0,5–20 μm mit größerer Wahrscheinlichkeit im Atemtrakt verbleiben und die Infektion verursachen. Die Ergebnisse der Studie könnten mit anderen Testmethoden verglichen werden, um die Effizienz der Bioaerosolentfernung in Heizungs-, Lüftungs- und Klimaanlagen (HLK) nachzuahmen.

Tabelle 1 fasst die Ergebnisse des Infektionstitertests (n = 3) des Viruseintrags (direkt am Eingang des Kunststoffschlauchs vom Zerstäuber gesammelt) und der auf den vor- und nachgeschalteten Filtern zurückgehaltenen Virustiter zusammen. Der Zerstäuber lieferte eine gleichmäßige Beladung mit Pseudovirus-Aerosolen in den Windkanal, wo in jedem Versuch insgesamt 9,60 × 105 ± 5,17 × 104 infektiöse Einheiten (IE) vernebelt wurden. Der mittlere Durchmesser des vom Zerstäuber erzeugten Aerosols und die Gesamtmenge der durch vor- und nachgeschaltete Filter gefilterten Virustiter in der Kontrollgruppe (d. h. unbehandelter Spunlace-Vliesfilter) waren vergleichbar mit anderen Windkanalstudien11,18, bei denen weniger Viren vorhanden waren Sowohl das Volumen als auch der Gesamtvirustiter wurden in unseren Versuchsaufbau eingegeben. Für die vorgeschalteten Filter betrugen die durchschnittlichen infektiösen Einheiten (IU), die auf den mit kationischem Polymer beschichteten und unbehandelten Spunlace-Vliesfiltern gefunden wurden, 2,65 × 103 ± 4,29 × 103 IU bzw. 4,47 × 105 ± 4,03 × 104 IU. Auf 2 von 3 mit C-POLAR™ behandelten Filtern im Test wurde kein nachweisbares lebensfähiges Virus gefunden. Der Durchschnitt und die Standardabweichung der Lebendzahlen für den CPS-Filter wurden unter Verwendung der Nachweisgrenze (dh 1,03 × 102 IU/Filter) berechnet.

Wie in Abb. 2 gezeigt, gab es eine signifikante Steigerung der Filtrationseffizienz von 74,2 ± 11,5 % für den unbehandelten Spunlace-Vliesfilter auf 97,2 ± 1,7 %, nachdem derselbe Filter mit C-POLAR™-Material beschichtet war (d. h. kationisch polymerbeschichteter Filter). (T-Test bei zwei Stichproben, p-Wert = 0,036). Beim Experiment mit einem mit kationischem Polymer beschichteten Filter wurde auch ein Rückgang der Titer auf dem nachgeschalteten Filter um eine Größenordnung festgestellt, was auf eine bessere Einfangeffizienz des mit C-POLAR™ beschichteten Filters im Vergleich zu einem unbehandelten Spunlace-Vliesfilter allein hinweist. Der pH-Wert des SARS-CoV-2-Aerosols ist im Allgemeinen alkalisch und steigt mit der Zeit an24, wobei die Polarität der Viruspartikel bei neutralem bis alkalischem pH-Wert negativ werden würde, da der isoelektrische Punkt des Virus im Allgemeinen unter 725 liegt. Die kationische Polarisationsmatrix wird auf dem Filter induziert Oberfläche durch das polymere C-POLAR™-Material, mit dem der Spunlace-Vliesfilter beschichtet ist, würde somit die Einfangeffizienz von Viruspartikeln im Aerosol verbessern.

Ergebnisse des Virustiters, die auf den vor- und nachgeschalteten Filtern gespeichert werden. Die Filtrationseffizienz der Proben wurde in Prozent ausgedrückt.

Verglichen mit den Ergebnissen von Zhang et al.21, die den MS2-Bakteriophagen als Modell verwendeten, war die Virusfiltrationseffizienz für den mit kationischem Polymer beschichteten Filter vergleichbar mit einem Filter mit minimalen Effizienzbewertungswerten (MERV) 14 bei ähnlicher Luftanströmgeschwindigkeit. Beim unbehandelten Spunlace-Vliesfilter war die Filtrationseffizienz etwas schlechter als bei einem MERV 12-Filter, was darauf hindeutet, dass die Anwendung von positiv polarem C-POLAR™-Material auf dem Filter die Stärke beim Aufhalten von Bioaerosol und den daraus resultierenden Bewertungswert verbessert.

Durch die Verwendung eines Infektionstitertests wurde festgestellt, dass die logarithmische Reduzierung und Entfernungseffizienz des mit kationischem Polymer beschichteten Filters 2,24 ± 0,038 bzw. 99,4 ± 0,051 % betrug, was bedeutet, dass der behandelte Filter den Pseudotyp SARS-CoV-2 effektiv inaktivieren konnte relativ hohe Anströmgeschwindigkeit. Verglichen mit der Verwendung einer dielektrischen Filterentladung, die SARS-CoV-2 durch die Erzeugung von Ozon und anderen sauerstoffreaktiven Spezies inaktivierte12, bieten behandelte Filter eine vergleichbare Entfernungseffizienz von Pseudotyp SARS-CoV-2, selbst bei einer viel höheren Anströmgeschwindigkeit (1,3 m). /s gegenüber 0,18 m/s) und es ist kein Energieverbrauch erforderlich. Purwar et al.22 schlugen einen dreischichtigen Filter aus omniphob beschichtetem Polypropylen/kupferbeschichtetem diamantähnlichem Kohlenstoff (DLC)/Vliesstoff (Hy-Cu) vor, der durch die lipophobe Eigenschaft zum Aufbrechen der Lipidhülle des Virus führte die obere Schicht und inaktivieren das Virus durch die Kupferoberfläche auf der mittleren Schicht. Aufgrund des Ergebnisses der Virusinaktivierung wurde festgestellt, dass der Hy-Cu-Filter mit DLC das MS2-Bakteriophagenvirus über einen Zeitraum von 2 Stunden (mit einer Einströmgeschwindigkeit von 0,01 m/s) zu 99 % inaktivierte, wobei der behandelte Filter in dieser Studie verwendet wurde kann sofort nach Abschluss des Aerosolsprühens in 5 Minuten zu mehr als 99 % inaktiviert werden.

Das Windkanalsystem in dieser Studie bewertete das lebensfähige Virus nur mithilfe eines infektiösen Titer-Assays in Verbindung mit der Technik der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), um die Genom-DNA aus infizierten Zellen durch Transduktion zu bestimmen, anstatt die quantitative Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion zu verwenden ( RT-qPCR)-Methode zur Bestimmung der aus Filterextrakten gewonnenen RNA, da die RT-qPCR-Technik durch den Nachweis längerer RNA-Fragmente, die von inaktivierten Viren freigesetzt werden, die auf den Filtern zurückgehalten werden, zu falsch positiven Ergebnissen führen kann26.

Mithilfe des entwickelten vertikalen Windkanalsystems wurde die Fähigkeit des mit kationischem Polymer beschichteten Filters zum Einfangen von Bioaerosolen und zur Inaktivierung des Pseudotyps SARS-CoV-2 experimentell bewertet. Bioaerosole, die den getesteten kationisch-polymerbeschichteten Filter passierten, zeigten eine signifikante Reduzierung um 97,2 ± 1,7 % der Filtrationseffizienz und 99,4 ± 0,051 % Entfernungseffizienz, was einen soliden Beweis für die Wirksamkeit des kationisch-polymerbeschichteten Filters im Kampf gegen das SARS-CoV liefert -2 Pandemie. Das Windkanalsystem kann den Bedienern eine gleichmäßige Viruslast, eine relativ hohe Luftgeschwindigkeit und eine sicherere Umgebung bieten. Zukünftig werden Studien zur Anwendung flexibler Design-Windkanäle vom vertikalen Typ auf Filter unter Verwendung anderer Mikrobenstämme durchgeführt und eine weitere Verbesserung der Leistung des Windkanalsystems vom vertikalen Typ in Betracht gezogen.

In dieser Studie wurden sowohl der mit C-POLAR™ behandelte Filter als auch der unbehandelte Filter (d. h. Vliesstoff-Spunlace-Filter auf Polyesterbasis) von C-POLAR™ Technologies (Nevada, USA) bezogen, wo der mit C-POLAR™ behandelte Filter hergestellt wurde Aufbringen eines Hochdruckstrahls einer 6 %igen wässrigen C-POLAR™-Polymerlösung auf den unbehandelten Filter, gefolgt von einer Inline-Trocknung des Filters. Bezüglich der physikalischen Leistung des mit C-POLAR™ behandelten Filters wurden die Mindesteffizienz-Berichtswerte (MERV) in Bezug auf die Partikelfiltrationseffizienz von MERV 8 (für den unbehandelten Filter) auf MERV 13 (für den mit C-POLAR™ behandelten Filter) erhöht Es wurde festgestellt, dass der Druckabfall des mit C-POLAR™ behandelten Filters bei einer Einströmgeschwindigkeit von 1,3 m/s etwa 31 Pascal beträgt. In dieser Studie wurden sowohl der mit C-POLAR™ behandelte Filter als auch der unbehandelte Filter in kreisförmige Proben mit 25 mm Durchmesser geschnitten. Für jeden Filter wurden drei Proben getestet (dh n = 3).

Um das Sicherheitsrisiko des aerosolisierten Virus zu verringern, wurde als Testvirus ein pseudotypisiertes Virus ausgewählt, dessen SARS-CoV-2-Spike-Protein auf der Hüllenoberfläche exprimiert wird und ein Reportergen für grün fluoreszierendes Protein (GFP) trägt, das in HEK293T produziert wurde Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers (InvivoGen, Hongkong, China, Kat.-Nr. PLV-SPIKE)27. Kurz gesagt, 70–80 % konfluente HEK293T-Zellen wurden mit dem Hüllplasmid pLV-Spike, dem Verpackungsplasmid und dem Transferplasmid, das ein GFP-Reportergen trug, mit LentiTran-Transfektionsreagenz (OriGene, Rockville, MD) transfiziert. Einen Tag nach der Transfektion wurde das Kulturmedium entfernt und die Zellen wurden zweimal mit frischem Medium gewaschen, um eine Verschleppung von Plasmid-DNA zu verhindern. Anschließend wurden 3 Tage lang täglich Zellmedien gesammelt, die pseudotypisierte Viren enthielten. Nach der Sammlung wurden pseudotypisierte virushaltige Medien 10 Minuten lang bei 1000 × g zentrifugiert und durch einen 0,45 µm Polyethersulfon (PES)-Spritzenfilter (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) filtriert, um Zelltrümmer zu entfernen. Die pseudotypisierten Viren im Filtrat wurden dann vor der Aliquotierung mit Amicon® Ultra 15-ml-Zentrifugalfiltern, nominalem Molekulargewichtslimit (NMWL) von 100 kDa (Merck Millipore, Darmstadt, Deutschland) konzentriert und vor der Verwendung bei –80 °C gelagert.

Die Idee bestand darin, die Filtrations- und Inaktivierungseigenschaften des neuartigen beschichteten Filters gegenüber Aerosolen mit dem Pseudotyp SARS-CoV-2-Virus unter einer bestimmten Anströmgeschwindigkeit in einem Windkanal zu bewerten. Der Aufbau und die Experimente wurden in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II (Esco Micro Pte. Ltd., Singapur) durchgeführt, in der die Temperatur und die Luftfeuchtigkeit der Umgebung bei 23 ° C bzw. 50 % relativer Luftfeuchtigkeit gehalten wurden. Der Aufbau des vertikalen Windkanals ist in Abb. 1 dargestellt, wo Aerosol des Pseudotyp-SARS-CoV-2-Virus in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) durch einen Kolbenkompressor-Zerstäuber (MEGANEB, Norditalien, Italien) erzeugt wurde ). Der Zerstäuber war so eingestellt, dass er ein Aerosol mit einem mittleren aerodynamischen Massendurchmesser von 1,72 ± 0,26 μm (geschätzt durch Besprühen mit 5 %iger Kaliumchloridlösung, wie im ASHRAE-Standard 52.2 für experimentelles Aerosol20 empfohlen) und einer konstanten Durchflussrate von etwa 0,2 ml/min erzeugt 5 Minuten für jeden Test. Der gesamte Viruseintrag aus dem Zerstäuber wurde gemessen, indem das Ende des Kunststoffschlauchs im Windkanal in ein Reagenzglas mit 5 ml DMEM getaucht wurde, um das erzeugte Aerosol aufzufangen, und anschließend mithilfe eines Infektionstitertests quantifiziert wurde. Für die Filtrationseffizienz und die SARS-CoV-2-Inaktivierungsstudie wurde das aerosolisierte Pseudo-SARS-CoV-2-Virus in den vertikalen Windkanal mit einem Innendurchmesser von 12,7 mm und einer Länge von 250 mm umgeleitet, wo sich der zu testende Filter und ein Polytetrafluorethylen befanden (PTFE)-Filter (Porengröße 0,22 μm) wurden an der stromaufwärtigen bzw. stromabwärtigen Position des Windkanals angebracht, um das Aerosol in einem Abstand von 62,5 mm zu sammeln. Eine Vakuumpumpe wurde in orthogonaler Position nach dem nachgeschalteten Filter angeschlossen, wobei die Durchflussrate mithilfe eines Inline-Durchflussmessers (LZB-10WB Senlod, Nanjing, China) auf 10 l/min eingestellt wurde, um das Aerosol und die Frischluft abzusaugen Die Eröffnung des Windkanals. Die Anströmgeschwindigkeit im Windkanal wurde auf etwa 1,3 m/s eingestellt. Nachdem 5 Minuten lang aerosolisiertes Pseudotyp-SARS-CoV-2-Virus unter den oben genannten Bedingungen durch die Filter geleitet wurde, wurden sowohl der Zerstäuber als auch die Vakuumpumpe ausgeschaltet und sowohl der vorgeschaltete als auch der nachgeschaltete Filter separat in 10 ml DMEM extrahiert Wirbel. Das auf dem Filter zurückgehaltene, durch DMEM extrahierte, lebensfähige Virus wurde durch einen Infektionstitertest quantifiziert. Die Filtrationseffizienz der getesteten Filter wurde anhand der folgenden Gleichung unter Verwendung der auf dem nachgeschalteten Filter zurückgehaltenen Virustiter und des Viruseintrags bestimmt:

Für die Virusinaktivierung wurde die logarithmische Reduktions- und Entfernungseffizienz des mit C-POLAR™ behandelten Filters durch Vergleich der im Infektionstitertest gefundenen Titer zwischen den unbehandelten und den mit C-POLAR™ behandelten Filtern bestimmt11:

Um das auf jedem der getesteten Filter zurückgehaltene Pseudotyp-SARS-CoV-2-Virus zu quantifizieren, wurden anhaftende menschliche ACE2- und TMPRSS2-exprimierende A549-Zellen (InvivoGen, Hongkong, China, Kat.-Nr. a549-hace2tpsa) mit den seriell verdünnten Zellen inkubiert DMEM-Extrakt aus dem getesteten Filter. Mit dem Pseudotyp SARS-CoV-2-Virus infizierte Zellen im verdünnten Extrakt wurden durch quantitative Polymerasekettenreaktion (qPCR) gemessen, wie von Barczak et al.28 mit einigen Modifikationen beschrieben. Kurz gesagt, 1 × 104 adenokarzinomische humane alveoläre Basalepithelzellen vom Typ A549 mit der Expression des humanen Angiotensin-Converting-Enzyms 2 (ACE2) und der Transmembran-Serin-Protease 2 (TMPRSS2) wurden in einer 96-Well-Platte bei 37 °C mit 5 % CO2 in einem kultiviert befeuchteter Inkubator (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). Als Zellkulturmedium wurde DMEM verwendet, das mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) geliefert wurde. Infektionen mit Pseudoviren wurden durch Zugabe von verdünntem Filterextrakt zu den Kulturmedien für die Zellkultivierung durchgeführt. Als Negativkontrolle wurde Kulturmedium ohne Zusatz von Filterextrakt verwendet. Im Filterextrakt verbleibendes lebensfähiges Pseudo-SARS-CoV-2-Virus kann die A549-Zellen infizieren und seine Genomsequenz durch Transduktion in das Genom der A549-Zelle integrieren. Drei Tage nach der Infektion wurde die genomische DNA aus den kultivierten Zellen mit dem Monarch® Genomic DNA Purification Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Um den Infektionstiter zu messen, wurde qPCR durchgeführt, indem auf das lentivirale spezifische Transgen (d. h. Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element (WPRE)) und ein Einzelkopie-Referenzgen (d. h. Albumin (ALB)) abgezielt wurde. qPCRs wurden in einem QuantStudio™ 3 Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, wobei das Reaktionsgemisch 10 μl Luna® Universal qPCR Master Mix (New England Biolabs, Ipswich, MA), 800 nM enthielt Für jeden Primer (vorwärts und rückwärts) 5 μl der genomischen DNA hinzufügen und das Endvolumen mit nukleasefreiem Wasser auf 20 μl auffüllen. Das Thermocycling-Programm zur Amplifikation des lentiviralen spezifischen Fragments (WPRE) und des Albumin-Gens (Alb) war wie folgt: 95 °C für 5 Minuten (anfängliche Denaturierung und Polymeraseaktivierung), gefolgt von 40 Zyklen bei 95 °C für 15 Sekunden, 60 °C für 30 s und 72 °C für 10 s (Erkennung). Am Ende der Reaktion wurde eine Schmelzkurvenanalyse (Bereich 60–95 °C) durchgeführt, um die Spezifität des qPCR-Produkts zu überprüfen, wobei die Schmelztemperatur des WPRE-Gens und des Albumins bei Tm = 84,5 °C und Tm = 77,2 °C lag C bzw. In jedem qPCR-Lauf wurden zehnfache Reihenverdünnungen des Transferplasmids für die pseudotypisierte Viruspräparation in bekannter Konzentration hergestellt, um eine Kalibrierungskurve für die Quantifizierung zu erstellen. Als Negativkontrolle wurde eine Probe ohne Vorlage verwendet.

Für die qPCR verwendete Primer:

ALB vorwärts 5′-TTTGCAGATGTCAGTGAAAGAGA-3′.

ALB-Reverse 5′-TGGGGAGGCTATAGAAAATAAGG-3′.

WPRE vorwärts 5′-GTCCTTTCCATGGCTGCTC-3′.

WPRE umgekehrt 5′-CCGAAGGGACGTAGCAGA-3′.

Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) ausgedrückt und die statistische Signifikanz wurde durch den Student-t-Test in GraphPad Prism 7.1 (San Diego, CA, USA) bestimmt. Die Daten wurden als signifikanter Unterschied angesehen, wenn der p-Wert weniger als 0,05 betrug.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor, ET-PS, erhältlich

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Die in diesem Artikel beschriebene Arbeit wurde teilweise durch das Research Matching Grant Scheme (Projekt Nr. 2020/1001) des Hong Kong Research Grants Council und den Faculty Advancement Fund der Hong Kong Metropolitan University unterstützt. Wir möchten uns bei C-POLAR™ Biotechnologies Limited dafür bedanken, dass sie uns mit C-POLAR™ behandelte und unbehandelte Filter zur Analyse zur Verfügung gestellt haben.

Forschungsabteilung, DreamTec Cytokines Limited, Hongkong, China

Johnny Chun-Chau Sung, Kam-Chau Wu und Keith Wai-Yeung Kwong

School of Science and Technology, Hong Kong Metropolitan University, Hongkong, China

Pak-Long Wu, Ellis Yung-Mau So, Sidney Man-Ngai Chan und Eric Tung-Po Sze

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ET-PS konzipierte das Design des vertikalen Windkanals und der Experimente. P.-LW und EY-MS halfen bei der Vorbereitung der Filterproben und des vertikalen Windkanals. JC-CS und K.-CW führten die Experimente durch. JC-CS und ET-PS analysierten die Ergebnisse, erstellten die Zahlen und verfassten das Manuskript. SM-NC und KW-YK standen während der gesamten Arbeit mit Rat und Tat zur Seite. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Eric Tung-Po Sze.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Sung, J.CC., Wu, PL., So, E.YM. et al. Bewertung eines neuartigen antiviralen Filters unter Verwendung des Pseudotyp-SARS-CoV-2-Virus in einem vertikalen Windkanal mit hoher Luftgeschwindigkeit. Sci Rep 13, 13947 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41245-8

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Eingegangen: 06. Juni 2023

Angenommen: 23. August 2023

Veröffentlicht: 25. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41245-8

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